hc8meifmdc|2011A6132836|PM_Website|tblnews|Text_News|0xfdff97d003000000b314000001000200
اثر وابستگی به مورفین بر گلیکوکانجوگه‌های اپیتلیوم اپیدیدیم در موش
با استفاده از روش لکتین هیستوشیمی
دکتر علیرضا
محمودیان*؛
دکتر فرزانه زمان سلطانی**؛
دکتر سیدحسن علوی*؛ دکتر علیرضا
فاضل*
چکیده
سابقه و هدف:
مطالعات نشان داده‌اند که تجویز مواد
مخدر در حیوانات باعث اختلالات فراوانی در باروری و غدد ضمیمه تناسلی می‌گردد. از سوی دیگر در بررسی‌های انجام‌شده بر نقش حیاتی گلیکوکانجوگیت‌ها در بلوغ
اپیدیدیمی اسپرم‌ها تأکید شده است؛ لذا این مطالعه با هدف پاسخ دادن به این سؤال
که آیا ممکن است تأثیرات نامطلوب مصرف مواد مخدر با ایجاد
تغییرات در این گلیکوکانجوگیت‌ها که
در بلوغ اسپرمی بسیار مهم هستند رخ دهد، انجام گردید. برای این منظور از لکتین‌ها استفاده شد که می‌توانند به طور اختصاصی قندهای انتهایی
گلیکوکانجوگیت‌ها را شناسایی کنند.
مواد و روش‌ها: 102 سر موش BALB/c
مذکر و بالغ به سه گروه مساوی تقسیم شدند. به گروه تجربی سولفات مورفین و به گروه
دیگر سرم فیزیولوژی تزریق شد.
گروه سوم نیز بدون تغییر بررسی شد. وابستگی مزمن با تزریق زیر جلدی و به صورت سه
بار در روز و به مدت 7 روز ایجاد شد(دوز دارو در روزهای 1 تا 7 به ترتیب: 10، 20،
40، 40، 80، 80 و 100 میلی گرم بر کیلو
گرم بود). سپس اپیدیدیم‌ها در هر سه گروه خارج شدند و بعد از تثبیت و طی مراحل معمول آزمایشگاهی از بلوک‌های پارافینی تهیه شده مقاطع 5 میکرومتری
به‌دست
آمد. این مقاطع با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی شدند. شدت واکنش‌ها در سلول‌های مختلف، بر اساس مطالعات مرتبط قبلی رتبه‌بندی شد (نمره صفر برای عدم واکنش، 1 برای
واکنش ضعیف، 2 برای واکنش متوسط و 3 برای واکنش قوی در نظر گرفته شد). سپس نتایج
با استفاده از آزمون آماری کراسکال والیس و
دان با یکدیگر مقایسه شدند.
یافته‌ها: میانگین شدت واکنش به (WGA) Wheat Germ Agglutinin
، اختصاصی برای قند اسیدسیالیک، بین گروه تجربی و گروه‌های شاهد و در کلیه سلول‌ها، تفاوت آماری معناداری نشان داد(05/0P<). در
مورد سایر لکتین‌ها که برای ردیابی
قندهای فوکوز، ان ـ استیل گالاکتوزآمین و دی ساکارید ان استیل گالاکتوزآمین ـ
گالاکتوز به کار برده شدند، تفاوت معنادار
آماری مشاهده نشد.
نتیجه‌گیری: کاهش واکنش به WGA،
نشان‌دهنده کاهش میزان اسیدسیالیک در
نمونه‌های تیمارشده با مورفین است.
با توجه به اهمیت اسیدسیالیک در حفاظت اسپرم‌ها
و بلوغ اپیدیدیمی آن‌ها، می‌توان پیش‌بینی‌کرد که به‌دنبال این کاهش، فرایند بلوغ اپیدیدیمی اسپرم‌ها دست‌خوش تغییرات
نامطلوبی خواهد شد. تأثیر مورفین در
محور هیپوتالاموسی ـ هیپوفیزی و ترشح هورمون‌های
آزاد کننده گنادوتروپین‌ها، اثر
مستقیم بر هیپوفیز و ترشح گنادوتروپین‌ها
و یا تأثیر در عوامل تنظیم‌کننده موضعی می‌توانند
از عوامل احتمالی بروز این تغییرات باشند.
کلیدواژه‌ها:
مورفین ـ گلیکوکانجوگیت، اسید سیالیک، لکتین، اپیدیدیم موش
«دریافت:3/11/1383 پذیرش:18/11/1384»
*استادیار
گروه علوم تشریحی و ژنتیک دانشگاه علوم پزشکی مشهد **استادیار گروه علوم تشریحی
دانشگاه علوم پزشکی قزوین
مقدمه
اپیتلیوم
اپیدیدیم و ترشحات آن در بلوغ اسپرم‌ها
نقش حیاتی دارند. سلول‌های این
اپیتلیوم، از نظر مورفولوژیک و هیستوشیمی متفاوت هستند(1). این اپیتلیوم اکثراًٌ از سلول‌های اصلی و قاعده‌ای
و به تعداد کمتری از سلول‌های فلاسک
یا باریک و روشن تشکیل شده است(2و3).
در سلول‌های فلاسک و روشن مقدار
فراوانی میتوکندری وجود دارد(3). عمل سلول‌های
فلاسک و روشن عمدتاًٌ ناشناخته مانده
است، ولی احتمالاً آن‌ها نیز در
ترشح گلیکوکانجوگیت‌ها دخالت
دارند(2). پروتئینی به نام H(+)-ATPase
نیز به مقدار فراوانی در این سلول‌ها
وجود دارد. نقش این پروتئین را اسیدی‌کردن
اپییدیدم عنوان کرده‌اند که با مقدار
فراوان میتوکندری‌ها در این سلول‌ها هماهنگی دارد(4). سلول‌های قاعده‌ای ممکن است سلول‌های
بنیادی برای ترمیم اپیتلیوم باشند(5). نقش سلول‌های اصلی را جذب آب از برون‌ده
بیضه و ترشح گلیکوکانجوگیت‌های
مرتبط با بلوغ اسپرم‌ها
می‌دانند. در ترشحات اپیدیدیم مقدار
فراوانی گلیکوکانجوگیت وجود دارد.
از جمله گلیکوپروتئین اسیدی اپیدیدیمی، گلیکوپروتئین
49
(GP-49)، گلیکوپروتئین
83 (GP-83)و آنتی‌ژن بلوغ اسپرم (Sperm
Maturation Antigen-4) می‌باشند که در سطح اسپرم بالغ موش وجود
دارد و در حین عبور از اپیدیدیم به آن افزوده می‌شود (1). GP-83، GP-49و SMA4
دارای قند انتهایی
اسید سیالیک می‌باشند(1، 6 و 7). SMA4 که
به‌وسیله سلول‌های
بخش پروگزیمال جسم اپیدیدیم ترشح می‌شود
و در حین انتقال اپـیدیدیمی به سطح تاژک اسپرم منتقل
می‌گردد، از چسبیدن دم به دم اسپرم‌ها در حین عبور یا ذخیره‌شدن در اپیدیدیم جلوگیری می‌کند(4). نقش GP-83 و GP-49در بلوغ اسپرم ناشناخته مانده
است(1). این دو گلیکوپروتئین که احتمالاً
توسط سلول‌های اصلی جسم اپیدیدیم
ترشح می‌شوند، در هنگام عبور اسپرم
از اپیدیدیم به غشای سر اسپرم منتقل
می‌گردند(6).
در
مورد قوچ نیز عبور اسپرم از اپیدیدیم و بلوغ آن با افزایش محتوای اسیدسیالیک اسپرم‌ها همراه است(8). اسیدسیالیک نقش مهمی در
پوشاندن نواحی آنتی‌ژنیک سطح اسپرم
دارد و باعث حفاظت اسپرم‌ها در حین
عبور از مسیر تناسلی مؤنث می‌شود.
یکی
از روش‌های بسیار سودمند که برای
ارزیابی و ردیابی گلیکوکانجوگیت‌ها
با قندهای انتهایی خاص مورد
استفاده قرار می‌گیرد، لکتین
هیستوشیمی است. لکتین‌ها آنزیم یا
آنتی‌بادی نبوده، سلول‌ها را آگلوتینه‌کرده و
باعث ته‌نشین شدن پلی‌ساکاریدها یا گلیکوکانجوگیت‌ها می‌شوند (9). لکتین‌ها تمایلات متفاوتی برای اتصال به کربوهیدرات‌های ویژه و اختصاصی دارند و ابزاری سودمند برای بررسی سطح سلول،
پی‌گیری تمایز و تغییرشکل سلولی می‌باشند(10).
از سوی دیگر، مطالعات صورت‌گرفته
قبلی، عوارض نامطلوب مصرف مواد مخدر را بر
باروری نشان داده‌اند. به عنوان
نمونه تزریق پتدین به موش‌های مذکر، باعث کاهش تعداد اسپرم‌های ناحیه دم اپیدیدیم و کاهش وزن غدد جنسی فرعی می‌شود(11). در یک بررسی با تزریق مورفین به موش‌های
مذکر، کاهش وزن بیضه‌ها، سمینال
وزیکول‌ها، اپیدیدیم و پروستات مشاهد
شده است. در همین بررسی پس از ایجاد وابستگی مزمن دارویی در موش‌های مذکر و جفت‌گیری آن‌ها با موش‌های
مؤنث سالم، کاهش تعداد جنین‌ها و
افزایش مرگ و میر نوزادان آن‌ها
گزارش شده است (12).
در
بافت بیضه سه نوع گیرنده اپیوئیدی به نام‌های
Mu ، Delta
و Kappa شناسایی شده‌اند.
این گیرنده‌ها نقش میانجی را در اعمال فیزیولوژیک و فارماکولوژیک
پپتیدهای اپیوئیدی با منشأ
داخلی و خارجی به عهده دارند(13). گرچه این گیرنده‌ها در بیضه شناسایی
شده‌اند، ولی در خصوص اپیدیدیم و سایر مجاری تناسلی مذکر گزارشی
نیافتیم.
مکانیسم‌های مولکولی پدیدآورنده تأثیرات نامطلوب ذکرشده کاملاً ناشناخته مانده‌اند، لذا در پاسخ به این سؤال
که آیا ممکن است تأثیرات نامطلوب مصرف مواد مخدر با ایجاد
تغییرات در این گلیکوکانجوگیت‌ها رخ
دهد، این مطالعه انجام گردید.
مواد و روش‌ها
1ـ حیوانات:
تعداد 102 سر موش مذکر بالغ از نژاد BALB/c تهیه‌شده از مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی
رازی مشهد در سنین 2 تا 4 ماهگی با وزن بین 25 تا 30 گرم انتخاب‌شدند. پس از توزین به‌طورتصادفی به سه گروه کنترل 1 یا گروه
طبیعی، کنترل 2 یا گروهی که
سرم فیزیولوژی دریافت کردند و گروه تجربی که سولفات مورفین دریافت کردند، تقسیم
شدند. تمامی حیوانات در شرایط استاندارد از نظر درجه حرارت (2± 22 درجه سانتی‌گراد)، رطوبت (5 ±50 %)، 12 ساعت روشنایی و تاریکی متناوب و دسترسی آزاد به آب و غذا نگهداری شدند.
2ـ ایجاد
وابستگی دارویی مزمن: میزان و
نحوه تزریق مورفین براساس جدول مقیاس‌بندی
دوز و پروتکل‌های ارایه‌شده
در منابع موجود تعیین‌گردید(14). به‌این‌ترتیب
که تزریق سولفات مورفین در 7 روز متوالی و به‌ترتیب
روزها 10، 20، 40، 40، 80، 80 و سرانجام 100 میلی‌گرم بر کیلوگرم به صورت زیرجلدی انجام‌شد. مقدار دارو منقسم بر سه بخش و به صورت سه بار در روز به
حیوانات تزریق گردید(14). برای
اطمینان از ایجاد وابستگی دارویی در
حیوانات در روز هشتم مقدار 5 میلی‌گرم
بر کیلوگرم نالوکسان تزریق شد(14). مشاهده پرش‌هایی که در آن چهار دست و پای حیوان همزمان
از سطح افقی فاصله می‌گیرد، به عنوان یکی از علایم وابستگی و سندرم ترک درنظرگرفته‌شد. سولفات مورفین و نالوکسان از طریق
معاونت دارو و غذای دانشگاه علوم پزشکی مشهد تهیه‌گردید.
برای حذف تأثیر احتمالی استرس تزریق بر نتایج تحقیق، به گروه کنترل 2 با حجم و
دفعات مشابه، سرم فیزیولوژی تزریق‌گردید.
3ـ آماده‌سازی
بافت‌ها و تهیه برش‌های بافتی: تحت شرایط بیهوشی، اپیدیدیم‌ها خارج و به مدت 48 ساعت در فیکساتیوB4G
قرارگرفتند. B4G شامل شش درصد کلرید مرکوریک، یک درصد
گلوتارالدئید و یک درصد استات سدیم می‌باشد(15و16). سپس مراحل آماده‌سازی معمولی، یعنی آب‌گیری
در الکل‌های صعودی، شفاف‌سازی در گزیلل، آغشته‌سازی و قالب‌گیری با پارافین را طی کردند و
از بلوک‌های پارافینی به‌دست‌آمده
برش‌های 5 میکرونی تهیه شد(17).
4ـ روش لکتین
هیستوشیمی: مقاطع، به منظور برداشتن کامل املاح مرکوریک موجود در فیکساتیوB4G به مدت ده دقیقه در محلول Alcoholic
Iodine (نیم درصد ید در الکل 70 درجه) قرارگرفتند. سپس
به منظور خنثی‌کردن پراکسیدازهای با
منشأ داخلی به مدت 45 دقیقه در محلول یک درصد آب اکسیژنه در
اتانول 70 درجه و در شرایط تاریکی قرار داده شدند (18). پس از شستشو به مدت نیم‌ساعت در محلول بافر فسفات سالین قرار گرفتند.
در روی هر لام 3 قطره از لکتین‌های ذکرشده در جدول 1 ریخته شد، به نحوی که کلیه قسمت‌های بافت به‌طورکامل توسط محلول لکتین دربرگرفته شود. کلیه لکتین‌ها به صورت رقیق‌شده و به نسبت 10 میکروگرم در یک میلی‌لیتر بافر فسفات استفاده شدند(15، 16 و 19). لکتین‌ها
به صورت کونژوگه باHorse Radish Peroxidase (HRP) و از شرکت Sigma Aldrich
خریداری شده بودند. پس از گذشت 2 ساعت، کلیه لام‌ها با بافر فسفات سالین شسته شد و به مدت ده دقیقه در مجاورتDiaminobenzidine
(DAB) با غلظـت 03/0 گرم در صد سی‌سی
بافـر فسفات که به آن 200 میکرولیتر آب اکسیژنه افزوده‌شده‌بود، قرارگرفتند. از آنجاکه اتصال لکتین به قند انتهایی قابل‌مشاهده
نیست، ازDAB استفاده می‌شود. اتصال این ترکیب با HRP
در مجاورت H2O2به
صورت رنگ قهوه‌ای ظاهر می‌شود. از آنجاکه HRP
نیز به لکتین متصل است، به‌طورغیرمستقیم
محل قندها مشخص می‌گردد. سپس کلیه
لام‌ها به مدت پنج دقیقه در محلول
آلسین بلو با pH= 2.5 (یک گرم آلسین
بلو در 97 سی‌سی آب مقطر و 3 سی‌سی اسید استیک گلاسیال) به منظور ایجاد رنگ زمینه قرار گرفتند (15، 16و 19).
5 ـ بررسی مقاطع
تهیه‌شده و جمع‌آوری یافته‌ها: لام‌ها با
استفاده از میکروسکپ نوری بررسی‌شدند.
واکنش به لکتین‌ها به صورت رنگ قهوه‌ای با شدت و ضعف‌های مختلف ظاهر می‌شود.
رتبه‌بندی شدت واکنش یا همان شدت رنگ
براساس مطالعات Arya
(20و21) و Burkett
(2) انجام‌شد. در این مطالعات که در روی بافت‌های بیضه و اپیدیدیم صورت گرفته است، کلیه واکنش‌ها براساس مشاهده و نظر محقق رتبه‌بندی می‌شود، به‌این‌ترتیب
که در صورت عدم مشاهده رنگ قهوه‌ای
در یک ساختمان یا سلول برای آن رتبه صفر در نظر گرفته می‌شود. رتبه 1 برای رنگ قهوه‌ای
کمرنگ یا واکنش ضعیف، رتبه 2 برای
واکنش متوسط یا رنگ قهوه‌ای متوسط و
رتبه 3 برای رنگ قهوه‌ای پررنگ یا
واکنش
جدول 1ـ لکتین‌های
مختلف به‌کار برده شده در مطالعه
|
نوع لکتین
|
علامت اختصاری مخفف
|
کربوهیدرات
اختصاصی
|
|
Glycine
Max (Soybean) Agglutinin
|
SBA
|
? |?-D-GalNAc*
|
|
Arachis
Hypogaea (Peanut) Agglutinin
|
PNA
|
D-Gal-**
(?1-3)-D-GalNAc
|
|
Lotus Tetragonolobus Agglutinin
|
LTA
|
? L-fuc***
|
|
Wheat
Germ Agglutinin
|
WGA
|
Sialic
Acid
|
***Fuc=Fucose *GalNAc=N-Acetylgalactosamine **Gal= Galactose
شدید در نظر
گرفته می‌شود. در هر گروه، یک لام از
هر موش بررسی شد و در مورد هر سلول میانگین رتبه‌های آن به‌دست آمد. سپس
میانگین‌های به‌دست‌آمده با استفاده آزمون آماری Kruskal-Wallis
مورد مقایسه قرار گرفتند.
این
آزمون که برای داده‌های رتبه‌بندی‌شده
به کار می‌رود، مشخص می‌کند که به‌طورکلی اختلافی بین گروه‌های
مورد بررسی وجود دارد یا خیر. چنانچه این
اختلاف وجود داشته باشد(05/0P<)،
برای مشخص‌کردن اینکه تفاوت بین کدام‌یک از دو گروه وجود دارد، آزمون Dunn
انجام می‌شود.
یافته‌ها
نتایج به‌دست
آمده در خصوص لکتین‌های LTA،
SBA و PNA
و مقایسه سه گروه با هم تفاوت معناداری
را نشان
نداد، ولی در مورد لکتین WGA
وضعیت متفاوت بود که نتایج آن در جدول 2 آمده
است.
با
توجه به اینکه در کلیه موارد به‌جز
سلول‌های قاعده‌ای ناحیه سر اپیدیدیم، بین گروه‌های مورد بررسی تفاوت معنادار آماری مشاهده می‌گردید (05/0P<)، برای مشخص‌نمودن
گروه‌هایی که این تفاوت بین آن‌ها وجود دارد، آزمون Dunn انجام‌شد. نتایج آزمون Dunn
در کلیه موارد نشان داد که این تفاوت آماری بین گروه کنترل 1.
جدول 2- نتایج آزمون Kruskal-Wallis
برای اختلاف بین میانگین گروه‌ها
|
بخش های مختلف اپیدیم
|
نوع سلول
|
گروه
|
نتیجه آزمون Kruskal Wallis
|
|
کنترل 1
|
کنترل 2
|
تجربی
|
|
سر
|
اصلی
|
50/0±51/1
|
50/0±48/1
|
36/0±15/0
|
0001/0<
|
|
قاعده ای
|
36/0±15/0
|
39/0±18/0
|
24/0±06/0
|
32/0
|
|
فلاسک
|
36/0±84/2
|
33/0±87/2
|
50/0±45/2
|
0001/0<
|
|
روشن
|
در این ناحیه وجود ندارند
|
|
جسم
|
اصلی
|
46/0±69/1
|
47/0±66/1
|
39/0±18/0
|
0001/0<
|
|
قاعده ای
|
49/0±39/2
|
50/0±42/2
|
43/0±75/0
|
0001/0<
|
|
فلاسک
|
48/0±36/2
|
50/0±42/2
|
33/0±87/0
|
0001/0<
|
|
روشن
|
43/0±75/2
|
50/0±57/2
|
39/0±18/1
|
0001/0<
|
|
دم
|
اصلی
|
39/0±18/1
|
46/0±69/1
|
29/0±09/1
|
0001/0<
|
|
قاعده ای
|
36/0±84/1
|
41/0±78/1
|
41/0±78/0
|
0001/0<
|
|
فلاسک
|
در این ناحیه وجود ندارند
|
|
روشن
|
24/0±93/2
|
24/0±93/2
|
33/0±12/2
|
0001/0<
|
لکتین SBA،
100×، در اسپرم‌های مجرا واکنش قابل‌ملاحظه‌ای مشاهده می‌شود و در ناحیه رأسی سلول‌های
اصلی نیز واکنش‌های خفیف تا متوسط
ملاحظه می‌شود. I:
بافت بینابینی، L: مجرای اپیدیدیم.
رنگ‌آمیزی‌شده
با آلسین‌بلو و لکتین SBA،
200×، در مقایسه با نمونه‌های طبیعی
مشابه، تغییر معناداری در شدت
واکنش‌ها مشاهده نمی‌شود.
I:
بافت بینابینی، L: مجرای اپیدیدیم.
در مقایسه با
گروه تجربی و گروه کنترل 2 در مقایسه با گروه تجربی وجود دارد، در حالی‌که بین گروه‌های
کنترل 1 و 2 تفاوتی وجود ندارد
بحث
نتایج به‌دست آمده نشان می‌دهند که با تجویز مورفین، شدت واکنش به لکتین WGA
در گروه تجربی در مقایسه با گروه‌های
کنترل به‌شدت کاهش می‌یابد
(تصاویر 5 و6). در صورتی که در مورد لکتین‌های
LTA (تصاویر 3 و4) و SBA
(تصایر 1و 2) و PNA این تفاوت مشاهده نمی‌شود. از آنجاکه لکتین WGA به طور اختصاصی به قند انتهایی اسید سیالیک متصل می‌شود، کاهش واکنش‌ها می‌تواند نشان‌دهنده کاهش میزان اسیدسیالیک در بافت مورد
بررسی و سلول‌های آن باشد. به نظر می‌رسد که
در میزان قندهای فوکوز و ان‌استیل‌گالاکتوزآمین و دی‌ساکارید گالاکتوز- ان استیل گالاکتوز آمین که به‌ترتیب توسط لکتین‌های LTA، SBA
و PNA ردیابی می‌شوند، تغییری به وجود
نمی‌آید.
مشاهده
واکنش‌های شدید سلول‌های روشن و نواحی رأسی سلول‌های اصلی و فلاسک به لکتین LTA
در نمونه‌های طبیعی (تصویر3) نشان‌دهنده وجود مقدار فراوانی قند ? L-fuc در این سلول‌ها و ترشحات آن‌ها می‌باشد، درحالی‌که عدم واکنش و یا واکنش‌های
بسیار خفیف به SBA در اپیتلیوم نشان می‌دهد که قند انتهایی D-GalNac
در ترشحات اپیدیدیم و همچنین بلوغ اسپرمی احتمالاً نقش مهمی ندارد (تصویر1). واکنش‌های قوی به WGA (تصویر5) نیز
در نمونه‌های طبیعی نشان‌دهنده وجود مقدار فراوانی اسیدسیالیک در اپیتلیوم و ترشحات آن خواهد بود
که برای بلوغ اسپرمی مورد نیاز است.
اسید
سیالیک در بلوغ اسپرم‌ها و لقاح نقش
مهمی دارد(1، 6 و 7) و در برخی
از عوامل رشد اپیدیدیمی مانند GP-83 وGP-49 (1و6) و
همچنین در ترکیب SMA4 که
مانع از آگلوتیناسیون اسپرم‌ها می‌گردد(7)، وجود دارد. همچنین باعث پوشاندن نواحی آنتی‌ژنیک سطح سلول و حفاظت آن می‌گردد (9). در نتیجه به‌نظرمی‌رسد
که با کاهش این عوامل مهم احتمالاً در فرایند بلوغ اپیدیدیمی اسپرم‌ها اختلال ایجاد شده است و به
دنبال آن از توانایی باروری و
همچنین میزان لقاح کاسته می‌شود. همچنین کاهش میزان اسیدسیالیک می‌تواند بیانگر ایجاد اختلال در عملکرد سلول‌های اپیدیدیم در ساخت و ترشح ترکیبات مورد
نیاز برای بلوغ اسپرم باشد.
در
مورد مکانیسم‌های احتمالی که ممکن
است باعث کاهش گیرنده‌های WGA
(اسیدسیالیک) و بروز اختلال در عملکرد اپیدیدیم شوند. می‌توان به
موارد ذیل اشاره نمود:
- اثر مورفین بر محور هیپوتالاموسی ـ هیپوفیزی و هورمون‌های آزادکننده گنادوتروپین‌ها. کاهش میزان هورمون آزادکننده LH
با تأثیرگذاری پتیدین در این محور قبلاً گزارش شده است (11).
- اثر مستقیم
مورفین بر هیپوفیز و ترشح گنادوتروپین‌ها.
بررسی‌های انجام‌شده کاهش سطح LH
سرم را در موش‌های مذکر و بالغی که تحت تأثیر مورفین قرار گرفته‌اند را نشان داده است
(23).
- تأثیر موضعی
مورفین در بافت بیضه و
ترشح آندروژن‌های بیضه‌ای:
کاهش سطح تستوسترون خون در موش‌هایی که مورفین دریافت کرده بودند، قبلا گزارش‌شده‌است(23). عمل
آندروژن‌ها برای تکامل و حفظ عملکرد
طبیعی سلول‌های اپیدیدیمی بسیار
ضروری است (4). به‌ویژه در ناحیه دم
اپیدیدیم ساخت ترکیبات و پروتئین‌ها
توسط آندروژن‌ها تنظیم می‌شود. از سوی دیگر در ناحیه سر اپیدیدیم و
خصوصاً بخش ابتدایی آن ساخت ترکیبات و پروتئین‌ها توسط عوامل موجود در مایع
بیضه‌ای تنظیم می‌گردد(22)؛ لذا کلیه تغییرات هورمونی ذکرشده با ایجاد تغییر در ترکیب
مایع بیضه‌ای نیز می‌تواند عملکرد اپیدیدیم را تحت تأثیر قرار
دهد.
- تأثیر مستقیم
مورفین در سلول‌های اپیتلیوم اپیدیدیم و ایجاد اختلال در
عملکرد آن‌ها: در مورد سیستم عصبی مرکزی، هیپوتالاموس، هیپوفیز و همچنین
بافت بیضه گیرنده‌های اپیوئیدی شناسایی شده‌اند (13 و 24)، ولی در مورد اپیدیدیم گزارشی در این
مورد نیافتیم. گرچه به احتمال زیاد سلول‌های
این بافت نیز مانند بیضه گیرنده‌های
ذکرشده را دارا هستند و ممکن است
مورفین با استفاده از این گیرنده‌ها
عملکرد سلول را تحت تأثیر قرار دهد.
در
مورد لکتین WGA، مقایسه قسمت‌های مختلف اپیدیدیم نشان می‌دهد
که به طور کلی ناحیه جسم و دم اپیدیدیم در مقایسه با سر، در پاسخ به مورفین،
تغییرات بیشتری را نشان می‌دهند. در
نمونه‌های طبیعی نیز ناحیه جسم و دم
واکنش‌های شدیدتری را در مقایسه با
سر نشان می‌دهند که می‌تواند بیانگر فعالیت بیشتر سلول‌های این نواحی در ساخت و ترشح ترکیبات
باشد، درحالی‌که در ناحیه سر واکنش‌های کمتر، می‌تواند نشان‌دهنده نقش
سلول‌های آن در جذب آب از برون بیضه
باشد.
از
آنجاکه تاکنون مطالعات مشابهی در ارتباط با تأثیرات
مواد مخدر بر گلیکوکانجوگیت‌ها انجام
نشده است، امکان مقایسه نتایج به‌دست آمده از این بررسی با سایر مطالعات
مشابه وجود ندارد.
در
خاتمه می‌توان چنین نتیجه‌گیری نمود که مصرف مورفین با کاستن از
مقدار اسیدسیالیک در سلول‌های
اپیتلیوم اپیدیدیم و اسپرم‌ها می‌تواند در فرایند بلوغ و حفاظت اسپرم‌ها اختلال ایجاد نماید.
نتیجه‌گیری
نتایج حاصل از
این بررسی نشان می‌دهد که تجویز
مورفین در موش‌های مذکر بالغ، منجر
به کاهش میزان قند انتهایی اسیدسیالیک در
سلول‌های اپیتلیوم اپیدیدیم و اسپرم‌های موجود در مجرای آن می‌شود. از آنجاکه اسیدسیالیک در فرایند بلوغ و حفاظت اسپرم‌ها نقش مهمی دارد، کاهش مقدار این قند
انتهایی ممکن است باعث بروز اختلال در فرایندهای ذکرشده گردد. به نظر می‌رسد که مصرف مورفین در میزان قندهای
انتهایی
دیگر نظیر فوکوز، ان‌استیل‌گالاکتوزآمین و دی‌ساکارید ان‌استیل‌گالاکتوزآمین ـ گالاکتوز تغییری ایجاد نمی‌کند.
تقدیر و تشکر
نویسندگان مقاله
کمال تشکر و قدردانی خود را از حمایت مالی وهمکاری‌های صمیمانه معاونت پژوهـشی دانشگاه علوم پزشکی مشهد ابراز می‌دارند. خدمات فنی خانم متجدد در امر کمک به انجام کارهای
آزمایشگاهی نیز قابل تقدیر است.
Abstract:
Morphine Dependency Effect on Mouse
Epididymis Epithelium by Means of Lectin Histochemistry
-
Mahmoudian A.R1.; Zamansoltani| F. 1; Alavi S.H.; Fazel A.R.1
1- Assistants
Professor in Anatomical Scienees of
Genetics | Mashhad University of Medical Sciences .
-
Introduction: Studies have shown that
opiates cause disorders in fertilization and accessory reproductive glands in
animals. On the other hand studies have shown important role of glycoconjugates
in sperm epididymal maturation. Lectins can detect glycoconjugates with
specific terminal glucose molecules. Therefore this study was conducted to
assess the possible effects of opiates on these important glycoconjugates in
sperm maturation. Lectins were used in
this study since they can bind with glucose terminal in specific manner.
Materials & Methods:
102 BALB/c adult male mice were assigned to three groups with 34 mice. The
experimental group was injected with sulphate morphine| control group by normal
saline and the third group was considered as intact group. Chronic drug
dependency was induced by three daily subcutaneous injections for 7 days (dose
on days from 1 to 7were: 10| 20| 40| 40| 80| 80 and 100 mg/kg respectively). After chronic drug
dependency induction| epididymides were dissected. Paraffin blocks were
obtained after fixation using routine laboratory methods. 5 µm sections from
the blocks were exposed to different lectins by means of lectin
histochemistry. Reaction intensity in
different cells was investigated by light microscopy and were ranked according
to the previous approved studies (0 = no reaction| 1= mild| 2 =moderate and 3 =
strong reactions). Kruskal-Wallis and Dunn tests were used for statistical
analysis.
Results: There was a
significant difference (p<0.05) in the reaction to wheat germ agglutinin
(WGA)| specifically for sialic acid between experimental and control groups. No
significant difference was found in using other lectins such as Galactose|
Fucose and Galactose- N Acetyl Galactoseamin.
Conclusion: Decreasing reaction to WGA
indicates reduction of sialic acid content in morphine treated samples. With
regard to sialic acid important role in sperm protection and epididymal
maturation| adverse changes in sperms epididymal maturation will be predicted
due to sialic acid deficiency in epididymal cells. Morphine effect on
hypothalamic-hypophyseal portal
system and secretion of
gonadotropin releasing hormones| direct effect on pituitary and secretion of
gonadotropins and effect on local regulatory factors may be more likely
mechanisms for these changes.
Key Words:
Morphine- Glycoconjugate- Sialic Acid- Lectin- Mouse Epididymis
منابع
1. Liu HW| Shang ST| Chao CF| Muller C. The
secretion of two sperm maturation-related glycoproteins in BALB/c mouse
epididymis. Cell Tissue Res 1991; 265(3):409-14.
2. Burkett BN| Schulte BA| Spicer SS.
Histochemical evaluation of glycoconjugates in the male reproductive tract with
lectin-horseradish peroxidase conjugates. Am J Anat 1987; 178(1):11-22.
3.
Arenas MI| Madrid JF| Bethencourt FR| Fraile B| Paniagua R. Identification of N-
and O-linked oligosaccharides in human epididymis. J Histochem Cytochem 1998;
46(10):1185-8.
4. Fisher JS| Pastor-Soler N| Sharpe RM|
Bretor S. Modulation of on of postnatal development of H (+)-ATPase rich
cells by steroid hormones in rat epididymis. Biol Reprod 2002; 67(4):1106-14.
5.
Williams PL| Bannister LH| Berry MM| Collins P| Dyson M| Dussek JE| et al. Gray’s
anatomy. 38th ed. New York: Churchill Livingston; 1995| PP. 1849-53.
6. Sun
GH| Lin YC| Cha TL| Yu DS| Chang SY| Liu HW. Conjugation of maturation-related
wheat-germ-lectin-binding proteins to caput epididymal sperm in co-cultures
with corpus epididymal epithelial cells of BALB/c mouse. Arch Androl 2000;
45(1): 43-52.
7. Feuchter FA| Tabet AJ| Green MF. Maturation
antigen of the mouse sperm flagellum: analysis of its secretion| association
with sperm| and function. Am J Anta 1988; 181(1): 67-76.
8. Ertl C| Wrobel Kh. Distribution of
sugar residues in the bovine testis during postnatal ontogenesis demonstrated
with lectin-horse radish peroxidase conjugates. Histochemistry 1992;
97(2):161-71.
9. Montreuil J| Vliegenthart JFG| Schachter
H. Glycoproteins II. Amsterdam: first ed;
Elsevier Science;1997| PP. 357-403.
10. Soderstrom KO| Malmi R| Karjalainen K.
Binding of fluorescein isothiocyanate conjugated lectins to rat spermatogenic
cells in tissue sections. Histochemistry 1984; 80(6):575-9.
11. Patil S| Patil S| Londonkar R| Patil
SB. Effect of pethidine on spermatogenesis in albino rats. Indian J Pharmacol 1998;
30(1):249-53.
12. Cicero TJ| Davis LA| Lar Regina MC|
Meyer ER| Schlegel MS. Chronic opiate exposure in the male rat adversely
affected fertility. Pharmacol Biochem Behav 2002; 72(1-2):157-63.
13. Jenab S| Morris PL. Interlukin-6
regulation of Kappa opioid receptor gene exoression in primary sertoli cells.
Endocrine 2000; 13(1):11-5.
14. Kest B| Palmese CA| Hopkins E| Adler
M| Juni A. Assessment of acute and chronic morphine dependence in male and
female mice. Pharmacol Biochem behav 2001; 70(1):149-56.
15. Fazel AR| Schulte BA| Thompson RP.
Lectin histochemistry of the embryonic heart: fucose-specific lectin binding
sites in developing rats and chicks. Am J Anat 1989; 184(1):76-84.
16. Fazel AR| Thompson RP| Sumida H|
Schulte BA. Histochmistry of the embryonic heart: Expression of terminal and
penultimate galactose residues in developing rats and chicks. Am J Anat 1989;
184(1):85-94.
17. Bancroft JD| Gamble M. Theory and
practice of histological techniques. 5th ed. New York: Churchill Livingston;
2002| PP. 86-8.
18. Gotz W| Qondumatteo F.
Glycoconjugate distribution in early human notochord and axial mesenchyme. Acta Histochem 2001; 103(1):21-35.
19. Ganji FC| Fazel AR. Lectin-binding
pattern in the microenvironment of the mouse developing T-cell. Ir Biomed J
2003; 7(1):19-22.
20. Arya M| Vanha-Perttula T. Distribution
of lectin binding in rat testis and epididimis. Andrologia 1984; 16(6):
495-508.
21. Arya M| Vanha- Perttula T. Lectin-
binding pattern of bull testis and epididymis. J Androl 1985; 6(4):230-42.
22. Jones R| Brown CR| Von Glos KI| Parker
MG. Hormonal regulation of protein synthesis in the rat epididymis: characterization
of androgen-dependent and testicular fluid-dependent proteins. Biochem J 1980;
188(3): 667-76.
23. Cicero TJ| O’Connor L| Nock B| Adams
ML| Miller BT| Bell RD| Meyer ER. Age-related differences in sensitivity to
opiate- induced perturbation in reproductive endocrinology in the developing
and adult male rat. J Pharmacol Exp Ther 1989; 248(1):256-61.
24. Wittert G| Hope P| Pyle D. Tissue
distribution of opioid receptor gene expression in the rat. Biochem Biophys Res
Commun 1996; 218(3):877-81.